SDS-PAGE电泳的基础原理和实验步骤

概述

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。此项技术的原理，是根据检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中，SDS-PAGE更是必不可少的操作，其通常用于检测蛋白的表达情况（表达量，表达分布），以及分析目的蛋白的纯度等。

SDS-PAGE作用机理

蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷，为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，鼎点平台在上样前，通常会进行一些处理(上样缓冲液)。即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上缓冲液。SDS 即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构； β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。电泳样品加入样品处理液后，经过高温处理，其目的是将SDS 与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷；另外样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程；另外样品处理液中还加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽的上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。

电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8 的上层，pH8.8 的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。出现了 pH 不连续和胶孔径大小不连续：启动时Cl?解离度大，Pro?解离度居中，甘 aaCOO?解离度�。ㄒ扑承蛭╬H6.8）Cl?> Pro? >—COO?。在 Cl?与 Pro?之间和 Pro?与—COO?之间都将出现低离子区，同时也出现高电势，高电势迫使 Pro?向 Cl?迁移，—COO?向 Pro?迁移。如：一个 Cl?领路，—COO?推动，蛋白在中间，这样就起到浓缩的作用了。在浓缩胶运动中，由于胶联度�。拙洞螅琍ro?受阻�。虼瞬煌牡鞍字示团ㄋ醯椒掷虢褐铣刹悖鹋ㄋ跣вΓ谷康鞍字蚀τ谕黄鹋芟呱�。当蛋白质进入分离胶时，此时Pro?，Cl?，甘 aa 离子在 pH8.8 的溶液中，Cl?完全电离而很快到达正极，甘 aa 电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。由于 Pro?在电泳过程中，受到溶液离子的变化而 pH 值发生变化，但每一瞬间，其所带电荷数除以单位质量是不同的，所以带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就现了电荷效应。由于胶孔径�。页晌桓稣宓纳缸唇峁梗嵌源蠓肿幼枇Υ螅》肿幼枇π。鹱欧肿由感вΓ簿褪堑鞍字试诜掷虢褐校苑肿由感в偷绾尚вΧ鱿智ㄒ坡实牟钜欤钪沾锏奖舜朔挚�。

PAGE 胶的聚合原理：甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸胺的作用下聚合，形成胶，如下图：

SDS-PAGE聚合

注：催化剂：过硫酸铵（AP）在隔氧的状态下，最好现配现用，使用新鲜的。

加速催化剂：TEMED，四甲基乙二胺。催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物。

SDS聚丙烯酰胺凝胶的分离范围：

丙烯酰胺浓度（％）	线性分离范围（KD）
15	10～ 43
12	12～ 60
10	20～ 80
7.5	36～ 94
5.0	57～212

试剂及主要器材

通常在SDS-PAGE电泳实验中用到以下几种试剂：

1、主要试剂

?30％凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加双蒸水至100mL。外包锡纸，4℃冰箱保存，30天内使用。
分离胶缓冲液(1.5mol／L): Tris 18.17g，加双蒸水溶解，6mol/L HCl调pH8.8，定容100mL。4℃冰箱保存
浓缩胶缓冲液(0.5mol／L): Tris 6.06g，加水溶解，6mol/L HCl调8，并定容到100mL。4℃冰箱保存
电极缓冲液(pH8.3)：SDS lg，Tris 3g，Gly 14.4g，加双蒸水溶解并定容到1000mL。4℃冰箱保存。
10％SDS，室温保存
质量浓度10％过硫酸铵(新鲜配制)
上样缓冲液：5mol／L Tris-HCl pH6.8 ?1.25mL，甘油2mL，10％SDS 2mL，β-巯基乙醇1mL，0.1％溴酚蓝0.5mL，加蒸馏水定溶至10mL。
考马斯亮蓝R-250染色液（1L）：1g考马斯亮蓝R250，加入450甲醇，100ml冰醋酸
脱色液（1L）：100ml甲醇，100ml冰醋酸
未知分子量的蛋白质样品(1mg／mL )

2、实验器材

垂直板电泳槽
电泳仪
长滴管及微量加样器
烧杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、 250m1)、培养皿(15cm?l5cm)
枪头（1ml、200ul、10ul）
注射器等

SDS-PAGE所需溶液：

A液——30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。

B液——1.5mol/L ?Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs碱，溶于60mL（30mL）去离子水中，加入约3mL(1.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。

C液——1.5mol/L ?Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs碱，溶于60mL（30mL）去离子水中，加入约7mL(3.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。

D液——10％SDS：10g (2g)SDS溶于去离子水中，定容至100mL(20mL)，加热至68℃助溶。

E液——10％过硫酸铵：5g(0.5g)过硫酸铵，溶于50mL(5mL)去离子水中；现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。

F液——TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，低温保存。

聚丙烯酰胺（Acrylamide）的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。

制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择TRIS-HCL系统。

TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行。

十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺（N,N’-Methylenebisacrylamide）时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。

SDS-PAGE实验标准操作流程

1. 清洗玻璃板

一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉 ?轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

2. 灌胶与上样

玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）
配 12％分离胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用 3ml的吸管或10ml 枪吸取适量的胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）

分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置12％的分离胶和5.1％的浓缩胶。

试剂名称	12%的分离胶(8块，35ml)	5.1%的浓缩胶（8块，12ml）
30％凝胶贮备液/ml	14	2
分离胶缓液（pH8.8）/ml	8.75
浓缩胶缓冲液（pH6.8)/ml		3
双蒸水/ml	12.25	6.9
10%过硫酸铵/ul	175	100
TEMED/ul	15	10

注：分离胶与浓缩胶的浓度计算公式：

A%*Va/V总 =C ，A%为30％凝胶贮备液，

例如，12%的分离胶：0.3*10/25=12%

当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
按前面方法配 5.1％的浓缩胶,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减�。佣辜友椎纳涎寤跣。栽谂ㄋ踅耗痰墓讨幸Ｔ诹奖卟菇�。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
测完蛋白含量后，计算含 50μg 蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至 0.5ml 离心管中，加入 5×SDS 上样缓冲液至终浓度为 1×。（上样总体积一般不超过 15μl，加样孔的最大限度可加 20μl 样品。）上样前要将样品于沸水中煮 5min 使蛋白变性。
加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3 次，以免交叉污染。

3.?电泳

加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电压控制在100～200V，大约15～20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电压升到200V，电泳过程保持电压稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2cm处即停止电泳，约0.5-1小时。如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。

4.?染色、脱色

电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.25％的考马斯亮蓝染液，染色2～4h，必要时可过夜。

弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。

5.?结果处理