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技术资源免疫组化技术IHC常用方法与实验流程

免疫组织化学（IHC）常用方法与实验流程

免疫组织化学技术（Immunohistochemistry Technique，IHC）是在免疫学、生物化学和显微镜技术基础上发展起来的免疫细胞化学技术。它利用可见的生物标记物标记特异性抗体，通过抗原抗体反应和组化呈色反应对相应组织细胞抗原进行定位、定性或定量测定的一项免疫检测方法。该技术巧妙地将免疫反应的特异性、组化的可见性和分子生物学技术的灵敏度有机地结合起来，借助荧光显微镜及电子显微镜的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测多种化学组分（如蛋白质、多肽、多糖、酶、激素、病原体及受体等），为疾病的诊断、鉴别诊断及发病机制的研究提供了重要手段。

免疫组化技术的优势

高特异性：抗原与抗体之间的结合具有高特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中特定抗原的显示。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。
高灵敏度：由于ABC法或SP三步法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。
样品易保存
结果易观察
可定量测定：可使用计算机图像软件检测积分光密度值达到定量的目的。
形态学研究与功能代谢研究相结合：该技术可通过了解组织和细胞中化学组分的分布与含量的测定，在一定程度上了解其代谢水平、代谢途径及功能作用，从而结合形态、功能、代谢三个维度进行研究。

免疫组化技术的常用方法及特点

免疫组化技术根据标记物的不同可构成不同的免疫组化方法，如使用荧光素或荧光蛋白标记可构成荧光免疫组化技术、使用酶标可构成酶免疫组化技术、标记金或铁可构成免疫胶体金或胶体铁组化技术、使用生物素标记可构成亲和组化技术。

荧光免疫组化技术

荧光免疫组化技术（fluorescence immunohistochemistry technique）是采用荧光素标记的已知抗体（抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），通过抗原抗体特异性反应，形成带有荧光素的特异性抗原抗体复合物，在荧光显微镜下，这种复合物上的荧光素受激发光照射而发出各种颜色的荧光，据此可以分辨出抗原（或抗体）所在位置或性质，并可利用荧光定量技术计算其含量，实现定位、定性和定量测定的目的。蛋白质、核酸、多肽、酶、多糖、激素、受体及病原体等凡可作为抗原或半抗原的物质均可用荧光免疫组化技术检测。

酶免疫组化技术

酶免疫组化技术（enzyme immunohistochemistry technique）是在免疫荧光技术基础上发展起来的，其基本原理与荧光免疫组化技术相同，所不同的是酶免疫组化技术是用酶标记抗体，与免疫荧光技术同为免疫组化中最常用的方法。
显色反应：酶+底物=不溶性的色素
常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（ALP）、葡萄糖样化酶（GOD）等，常用的供氢体有二氨基联苯胺（DAB）。

胶体金或胶体铁组化技术

免疫胶体金技术是一种以胶体金为标志物的技术。这种特殊的金属颗粒是金的水溶胶形式，可以快速稳定地结合蛋白质，且对蛋白质的生物活性几乎没有影响。因此，胶体金是一种理想的材料，可以与一抗、二抗或其他一些可以结合IgG（如葡萄球菌A蛋白）的蛋白质结合，以定位切片组织或培养细胞中的某些抗原。由于胶体颗粒大小的差异及其较高的电子密度，免疫胶体金技术适用于免疫电子显微镜和光学显微镜下的单标记或多标记检测。

亲和组化技术

亲和组化技术（affinity histochemistry technique）是以一种物质对某种组织成分具有高度亲和力为基础建立的组化技术。一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素（lectin）、生物素（avidin）和葡萄球菌A蛋白（SPA）等，对某种组织成分具有高亲和力及多级放大效应，能偶联抗体等大分子生物活性物质，并可与荧光素、酶、放射性核素、铁蛋白及胶体金等标记物有机结合，采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应、放射自显影或电子显微镜等，在细胞和亚细胞水平进行对应亲和物质的定位、定性或定量分析。该技术具有高灵敏度、操作简单、省时等优点，尤其是具有多级放大效应，因而更有助于微量抗原（或抗体）在细胞和亚细胞水平的定位、定性或定量分析。

免疫组化的基本实验过程

主要包括：

特异性抗体的制备与抗体的纯化
标记抗体的制备与纯化
标本的处理与制备?
组织材料的处理对于免疫组织化学技术至关重要。在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态的完整性，保持化学成分和酶的活性，更要保持组织细胞成分的抗原性。
标本的来源主要有以下几种：
①活体组织各种实验动物和人体活检组织
②各种体液及穿刺液
③培养细胞
STEP 1：标本固定
将组织置于某些化学试剂中，使细胞内的物质尽量接近于其生活状态时的形态结构和位置称为固定，其基本原则是不损伤细胞形态、不干扰固定后抗体对抗原的识别和结合。
常用的固定方法有浸泡法、蒸汽法、注射灌注法、微波法。
STEP 2：制片
免疫组化最常用的制片方法是冷冻和石蜡切片。为了使抗原达到最大限度的保存，首选的制片方法是冷冻切片。其操作简便，可避免石蜡切片因固定、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失，适用于不稳定的抗原。研究形态学的主要制片方法是石蜡切片，它不但是观察组织细胞结构的理想方法，而且可用在陈旧石蜡包埋材料免疫组织化学的回顾性研究。石蜡切片的优点是切片薄而有连续性，可长期保存。但对抗原的保存不如冷冻切片。
STEP 3：抗原修复
在制片过程中，甲醛使得组织切片中的蛋白质发生凝固，在凝固过程中可引起蛋白质自身和不同的蛋白质之间通过甲基化桥使蛋白质发生交联，广泛的蛋白交联可导致蛋白质的三级或四级结构的折叠方向发生改变，同时抗原与其他分子间也会发生交联，致使抗原信号减弱或消失。因此，使组织抗原决定簇重新暴露，即抗原修复是免疫组织化学技术中的重要步骤。
抗原抗体反应及标记物的显色反应
结果观察

免疫组化中常见问题分析

非特异性背景染色原因与解决方法：

1）操作过程种漂洗不充分，可增加漂洗次数和漂洗时间；2）加试剂后未保湿导致切片变干，需在湿盒中反应避免切片变干；3）组织切片发生折叠；4）未阻断组织种含有过氧化物酶，可使用新鲜配置的3%双氧水封闭并延长孵育时间；5）未封闭组织内源性生物素，可使用阻断剂阻断内源性的生物素；6）组织抗原发生弥散；7）切片黏附剂过厚；8）组织蛋白封闭不充分。

染色强原因与解决方法：

1）一抗浓度过高或抗体孵育时间过长；2）孵育温度过高，应该在室温20~28℃孵育，或4℃过夜；3）生物素化二抗孵育时间过长；4）DAB显色时间过长或DAB浓度过高，应保证显色时间不超过5~10分钟。

染色弱原因与解决方法：

1）抗体浓度过低或孵育时间过短，可增加抗体浓度，且保证服务时间不少于60 min；2）室温过低，可适当延长孵育时间内；3）组织固定和包埋处理后抗原被破坏，应及时固定新鲜组织，防止自溶；4）蛋白过度封闭，可适当缩短封闭时间；5）复染或衬染太深。

染色假阴性原因与解决方法：

1）一抗与二抗不匹配；2）组织中可能无抗原，建议设立阳性对照实验组。

参考文献
[1]王兰兰，许化溪.临床免疫学检验（第5版）[M].北京：人民卫生出版社，2012
[2]吴秉铨，刘彦仿.免疫组织化学病理诊断[M].北京科学技术出版社，2007.

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