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技术资源抗体改造与应用专题免疫胶体金技术的应用

免疫胶体金技术的应用

免疫胶体金技术在电镜上的应用

20世纪人们将电镜技术与免疫学方法相结合，逐步形成了免疫电镜检查术。随着胶体金标记技术的发展，该技术逐渐被引入到免疫电镜技术中来。胶体金是用于免疫电镜的最佳标记物，因为它呈球形，非常致密，在电镜下具有强烈反差，容易追踪在电镜下检出抗原抗体复合物。胶体金免疫电镜技术已成为目前最常用的免疫细胞化学方法之一，它具有灵敏度高、特异性强、定位精确等优点，同时它还可以对抗原进行定性、定量、定位的分析与观察。应用免疫金双重或多重标记法，可将形态、功能和结构的研究融为一体，有助于了解同一组织或细胞内不同分子间的相互关系，以及它们的合成、分泌、转运等代谢过程。如通过直接电镜、免疫电镜、胶体金免疫电镜技术等3种不同电镜技术观察新城疫病毒，结果证明用胶体金免疫电镜技术观察时由于视野中病毒粒子周围有胶体金颗粒附着，金颗粒呈现强烈的反差，很容易找到病毒粒子，免疫金标记可以显著的提高样品的病毒检出率。再如建立用免疫胶体金电镜检测技术检测犬细小病毒，证明免疫胶体金电镜技术有助于提高CPV检出率和特异性。

免疫胶体金技术在生物传感器上的应用

近年来金标记被引入生物传感器中的应用研究增多。已有许多致力于信号放大免疫传感器的研制报道，其中应用较多的是通过阻抗信号的变化来检测抗原（抗体）的含量。研究人员通过交流电导法检测了在叉指电极上的金标记的免疫凝集，从而实现了胶体金免疫层析试验的电化学检测方法，并且通过在胶体金上包被导电聚合物聚苯，提高电导法测定金标免疫反应的灵敏度。再如在标记胶体金标记A蛋白的基础上，制作了诊断森林脑炎的电化学免疫传感器，检测血清中的森林脑炎抗体及其浓度；基于铂金电极修饰的胶体金提高了生物传感器检测HABS表面抗体敏感性和稳定性；用基于胶体金表面等离子共振效应的电感受器测定胃蛋白酶的亲和常数。

免疫胶体金快速诊断技术

免疫胶体金快速诊断技术，由于方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观，并可保存试验结果等优点，已在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用。目前，医学检验中应用的免疫胶体金快速检测技术主要有快速斑点免疫金渗滤法（DIGFA）和胶体金免疫层析法（GICA）两种方法。这两种方法都是以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上包被的抗体或抗原结合，再用胶体金标记物与之反应形成红色可见结果从而达到检测目的。

斑点免疫金渗滤法

斑点免疫渗滤技术是20世纪80年代中期从固相酶免疫测定技术发展起来的较简便的固相标记免疫测定方法，该技术主要应用微孔滤膜（NC膜）作载体的免疫检测技术，先将抗原或抗体点于NC膜上，封闭后加待测样品，洗涤后用胶体金探针检测相应的抗原或抗体。通过金颗粒来放大免疫反应系统，使反应结果在固相载体NC膜上显示出来。研究表明免疫胶体金斑点渗滤法比间接过氧化物酶法更为敏感。

利用斑点免疫金染色法检测PPV抗体，对猪细小病毒病抗体最小检出量可达1.008×10^-10g/mL，并且不同猪布鲁氏菌病、猪伪狂犬病、猪衣原体病、猪口蹄疫、猪瘟及猪弓形体病等的阳性血清出现交叉反应。通过用胶体金标记SPA建立检测猪瘟抗体水平的斑点免疫金渗滤法检测试纸盒与目前猪瘟的常规检测方法dot-ELISA法和间接血凝试验同时对200份猪血清进行猪瘟抗体检测比较，符合率达98.14%和98.19%，说明该法特异、灵敏。特异性地检测猪流行性乙型脑炎病毒抗体的斑点金免疫渗滤测定法，与血凝抑制试验（HI）对比检测了54份猪血清临床样本，两种方法的阳性符合率为71.14%、阴性符合率为65.15%、总符合率为81.14%。应用胶体金标记纯化的兔抗沙门氏菌抗体-1，SPA包被硝酸纤维素膜作对照点，建立直接检测沙门菌的斑点免疫金渗滤法（DIGFA）检测试纸盒最低检测量为4.5×10⁶CFU/mL，将该法与国标法检测效果比较，符合率达100%。对布鲁氏菌病监控地区重点人群和不同职业人群采用斑点金免疫渗滤法（DIGFA）和试管凝集试验（STA）检测结果表明重点人群两种方法检测抗体阳性符合率为96.66%，阴性符合率为99.92%；不同职业人群两种方法检测阳性符合率为96.36%，阴性符合率为99.92%。该法敏感性和特异性与ELISA法具有良好的相符性，且具有反应快、操作简便、结果易于观察等优点，标记好的诊断试剂盒可以长期保存，随时使用，更适合于基层推广应用。

胶体金免疫层析法胶体

金免疫层析技术是20世纪90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的检测技术，由Beggs等最先用于人绒毛膜促性腺激素（HCG）的测定。近年来该技术发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。

胶体金快速诊断试纸条主要是将特异性的抗原或抗体以条带状包被在NC膜的检测线T上，胶体金标记的抗原或抗体吸附在结合垫上，当待测样品加到试纸条一端的加样孔上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记的抗原或抗体，再移动至包被的抗原或抗体的检测线处，如果样品中含有相应的抗体或抗原，包被在检测线上的抗原或抗体和胶体金标记物与样品中的相应抗体或抗原结合，形成免疫复合物，胶体金富集在检测线处形成一条可见的紫红色线。如果待检血清中没有相应抗体，胶体金标记物将不会与包被在检测线上的抗原或抗体结合，胶体金不会富集，检测线上不会出现紫红色色线。当样品与溶化了的胶体金标记物继续往上移动至对照线时，就与包被在对照线处的特异性抗体或抗原结合，在对照线上形成免疫复合物，出现一条胶体金富集的紫红色色线。

在实际应用上，有研究人员利用猪瘟金标免疫层析试纸测试30份标准阳性血清和18份标准阴性血清，结果阳性、阴性符合率100%。与ELISA试剂、dot-ELISA试剂及正向间接血凝进行比校试验，检测血清样品205份，结果阳性率ELISA为86.8%，金标层析法为85.4%，dot-ELISA为81.5%，正向间接血凝为58.5%。应用检测口蹄疫（O型）抗体水平的免疫胶体金快速检测试纸法，与口蹄疫正向间接血凝抗原法对300份猪、鸡、鸭、牛、羊等血液或血清进行口蹄疫抗体水平检测试验，符合率达100%。这种检测技术具有操作简单快速，特异性、敏感性好，可单份测定，结果直观，且可保存试验结果，无须特殊仪器等优点，适合于广大基层单位、医院、野外作业人员以及大批量时间紧的检测和大面积普查等，因此该技术具有巨大的发展潜力和应用前景。

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